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MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2

loading buffer

EDTA

Blue Dextran

bidest

25 mM

0.5 µl

ad 500 ml

Stop-Mix

Formamid : loading buffer = 5 : 1

2.9.2 Sequenzierung mit MegaBACE 1000 bzw. MegaBACE 4000

Bei den Geräten der MegaBACE-Reihe handelt es sich um Kapillarsequenzierungs-

einheiten mit 96 (MegaBACE 1000) bzw. 384 (MegaBACE 4000) Kapillaren. Bei die-

sen Sequenzierautomaten wird markierte DNA in dünnen Glaskapillaren von ca. 100

µm Durchmesser, die eine Polyacrylamid-Matrix enthalten, elektrophoretisch aufge-

trennt. Da die Proben mittels angelegter Spannung in kleinsten Mengen in die Kapilla-

ren injiziert werden, können mit jedem Reaktionsansatz fast unbegrenzt viele Sequen-

zierreaktionen durchgeführt werden. Zudem ist keine Möglichkeit zur Verwechslung

der Ansätze gegeben, die im Gegensatz zur Sequenzierung im Plattensequenzierer ein-

zeln injiziert werden. Allerdings kann es aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Auf-

tragungsmethode leicht zu Verstopfungen der Kapillaren kommen, wenn die Injektions-

zeit zu lang oder die Injektionsspannung oder die Konzentration der Template-DNA im

Reaktionsansatz zu hoch gewählt werden.

10 µl Sequenzieransatz wurden nach Programm in Tab. 2.8 amplifiziert und danach mit

24 µl 80 % Isopropanol (v/v) und 40 µl 80 % EtOH gefällt.

MegaBACE-Sequenzieransatz

DNA

Primer (5 pmol)

DYEnamic ET Dye Terminator Kit

HPLC

400 ng

1 µl

4 µl

ad 10 µl

1 2 ... 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 ... 185 186

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