MTD 243-670 Uživatelský manuál Strana 33
- Strana / 186
- Tabulka s obsahem
- KNIHY
Hodnocené. / 5. Na základě hodnocení zákazníků
MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2
Die in den Tab. 2.4 und Tab. 2.5 dargestellten Programme für die PCR-Amplifikation
mit Standard- und TripleMaster-Ansatz wurden gegebenenfalls angepaßt, um unge-
wöhnliche DNA-Bereiche zu amplifizieren. Durch Erhöhung der annealing-Temperatur
und Verlängerung der Denaturierungs-Schritte konnte die Spezifität der Amplifikatio-
nen bzw. die Erfolgsquote für Bereiche hoher G+C-Konzentrationen verbessert werden.
2.7.2 GenomiPhi-Amplifikation
Das GenomiPhi
TM
DNA Amplification Kit (Amersham Biosciences, Freiburg) wurde für
die hocheffiziente, unspezifische Amplifikation gesamtgenomischer DNA genutzt. Es
beruht auf der Verwendung einer hochprozessiven modifizierten Phi29-Polymerase mit
Strang-Verdrängungs-Eigenschaften in Verbindung mit einem Gemisch zufälliger He-
xamer-Primer. Innerhalb des R. eutropha H16-Genomprojektes wurden geringe Mengen
des aufgereinigten Chromosoms 2 nach Protokoll mit dem GenomiPhi-Kit amplifiziert
und für die Herstellung einer selektiven Genbank genutzt.
2.8 Genbanken
Eine gute Genbank ist die Grundlage eines erfolgreichen Genomprojektes. Bei der Se-
quenzierung mit dem whole shotgun approach ist es entscheidend, eine gleichmäßige
Verteilung des gesamten Genoms auf die Genbank zu erreichen. Bei der Sequenzierung
einer Genbank, in der das Genom statistisch verteilt vorliegt, kann die Abnahme der
verbliebenen Sequenz-Lücken nach der Assemblierung in Abhängigkeit von der Anzahl
der Sequenzläufe nach der Formel von Lander & Waterman (1988) berechnet werden.
Für die Sequenzierung größerer Genomprojekte bietet sich die Herstellung mehrerer
Genbanken unterschiedlicher Insertgröße an. Dabei kann eine gleichmäßige Abdeckung
des gesamten Genoms durch Assemblierung einer hohen Anzahl von Sequenzläufen ei-
ner Plasmid-Genbank mit geringer Insertgröße erreicht werden. Für die genomweite
Anordnung der Contigs aus den assemblierten Sequenzläufen der Plasmid-Genbank
kann dagegen eine geringe Anzahl von Sequenzläufen einer Cosmid-Genbank mit lan-
ger Insertgröße verwendet werden.
22
- Inhaltsverzeichnis 3
- Abkürzungsverzeichnis 8
- 1 Einleitung 12
- 2 Material und Methoden 16
- 2.2 Nährmedien und Puffer 17
- 2.2.2 Medienzusätze 17
- 2.3.1 Zellanzucht 18
- 2.3.2 Stammhaltung 20
- 2.4.1 Geräte und Lösungen 20
- 20x TAE-Puffer 22
- 2.4.10 Scheren von DNA 25
- 2.5.1 Restriktion 26
- 2.5.2 Dephosphorylierung 26
- 50 µl Ansatz 27
- 70 µl Ansatz 27
- 2.5.5 Ligation 28
- 2.6.1 TOPO TA-Klonierung 28
- 4 µl Ansatz 29
- 2.7 Amplifikationen 30
- 2.8 Genbanken 33
- 2.8.1 Plasmidbanken 34
- 2.9 Sequenzierung 34
- „½-LGA“-Sequenzieransatz 35
- Stop-Mix 37
- MegaBACE-Sequenzieransatz 37
- 2.11 Lückenschluß 39
- 2.11.1 Primerwalking 39
- 2.11.2 Lückenschluß mit PCR 40
- 2.11.3 Multiplex-PCR 41
- 2.12 BLAST 42
- 2.12.1 Bidirektionaler BLAST 42
- 2.13.3 Annotation in ERGO 44
- 2.14 Kumulativer GC-Skew 46
- 3 Ergebnisse 48
- Pile-ups assemblieren 53
- Pile-ups 53
- Bsp143I 56
- 3.I.1.5 Lückenschluß 58
- 3.I.1.6 Sekundärstrukturen 58
- R. eutropha H16 werden noch 59
- 3.I.2 Sequenzanalyse 60
- 3.I.2.1 G+C-Gehalt 63
- Bu. pseudomallei K96243 65
- Bo. bronchiseptica RB50 65
- 3.I.2.3 RNA-Gene 66
- 3.I.2.5 Annotation 68
- R. eutropha (H16_B1213) 80
- R. eutropha nachge 80
- R. eutropha 81
- et al., 1974) 81
- R. eutropha um zwei weitere 81
- 3.I.4.2.1.4 Acetoin-Abbau 88
- 3.I.4.2.2.1 Cyanat-Hydratase 89
- 3.I.4.2.2.2 Formamidase 89
- 3.I.4.4 Kdp-ATPase 92
- 3.I.4.5 Begeißelung 93
- R. solanacearum, die aller 94
- 5 7 8 9 10 11 126 13 14 96
- 3.I.4.6.2 Potentielle Toxine 97
- 3.I.4.6.2.1 RTX-Toxine 97
- 3.I.4.6.2.2 Tc-Toxine 99
- eutropha iden 100
- 3.II.1.1 Strategieanpassung 101
- 3.II.1.2 Rohsequenzierung 102
- Anzahl der Sequenzläufe 103
- Sequenzlücken 103
- 3.II.1.4 Lückenschluß 104
- 3.II.2 Sequenzanalyse 106
- Deletion 107
- Gene der Methanogenese 108
- Hoch-exprimierte Gene 108
- RNA-Gene 108
- Skalierung 108
- (1998) 110
- ERGEBNISSE KAPITEL 3 111
- Methanogenese 113
- Methanol + H 113
- Msp. stadtmanae 115
- Mth. thermautotrophicus 115
- 3.II.4 CO 117
- -Reduktionsweg 117
- 3.II.5 Genomvergleiche 121
- GKxxxKxNGRT MKNK 129
- DISKUSSION KAPITEL 4 136
- R. eutropha H16 141
- R. eutropha JMP134 141
- R. solanacearum GMI1000 141
- R. metallidurans CH34 141
- R. eutropha H16 C. necator N1 143
- 4.I.10 Ausblick 144
- 4.II.3 Kommensalismus 147
- 4.II.3.1 Zellwandsynthese 148
- 4.II.3.2 Überlange ORFs 150
- 4.II.5 Ausblick 154
- ZUSAMMENFASSUNG KAPITEL 5 155
- Burkholderiaceae 155
- Msp. stadtmanae-spezifischer 157
- 6 Literaturverzeichnis 158
- Lebenslauf 186
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