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4 Material und Methoden

4.9.22 Herstellen einer partiellen Genbank

Die Erstellung einer partiellen Genbank wurde nach Sambrook und Russell (2001)

durchgeführt. Dazu wurde genomische DNA mit einem Restriktionsenzym behandelt

und in einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt. Für die Restriktion wurde ein Enzym

gewählt, das glatte Enden generieren, da die erhaltenen Fragmente nach Anhängen

eines Adenyl-Restes in einen Vektor mit Thymidyl-Überhang eingesetzt werden

sollten. Nach dem Auftrennen der DNA wurde die Größe des zu untersuchenden

Fragments mittels einer Southern-Blot-Analyse bestimmt. Dabei wurde in der

Hybridisierung eine Sonde eingesetzt, die komplementär zu einem Teilabschnitt des

Fragments war. Insgesamt 10 µg der behandelten genomischen DNA wurden erneut

in einem Agarosegel aufgetrennt und die DNA aus dem Bereich ausgeschnitten,

dessen Größe zuvor mit der Sonde ermittelten worden war. Anschließend wurden die

Fragmente eluiert, nach Herstellerangaben mit Shrimp-Alkalischer-Phosphatase

(MBI Fermentas, St. Leon-Rot

) behandelt und danach gefällt. Der Niederschlag

wurde in destilliertem H

O gelöst und zu 50 µM mit dATP in 50 µl Reaktionspuffer

(Taq-Reaction-Buffer, Eppendorf, Hamburg) vermischt. Nach Zugabe von 1U Taq-

Polymerase (Taq DNA Polymerase, Eppendorf, Hamburg) erfolgte eine Inkubation

für 2 h bei 72°C. Die DNA wurde erneut gefällt, in 10 µl destilliertem H

aufgenommen und nach Angaben des Herstellers in den Zielvektor (TOPO TA

Cloning, Invitrogen, Karlsruhe) eingefügt. Dafür wurden 3 µl der DNA-Fragmente (ca.

100 fmol) und 1 µl des Vektors (ca. 4 fmol) verwendet. Die anschließende

Transformation erfolge mit dem gesamten Ligationsansatz und chemisch

kompetenter E. coli Top10-Zellen. Diese wurden zunächst nicht zur Selektion auf

Festmedium ausplattiert, sondern die Zellen wurden direkt mit Antibiotikum versetzt

und über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Zellzahl der Kultur mit

einer Helber-Zählkammer bestimmt, ca. 1000 Zellen auf antibiotikahaltigem

Festmedium ausplattiert und eine positiv geladene Nylonmembran (Roti

-Nylon plus,

Carl Roth, Karlsruhe) direkt auf die Oberfläche der Platten gelegt. Nach 12 h bei

37°C wurde die Membran a/jointfilesconvert/481994/bgenommen und zur Koloniehybridisierung verwendet.

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